目的:探究miR-135b-5p在小鼠脓毒症(sepsis)引起的急性肺损伤(ALI)模型中的表达水平及其对小鼠肺部炎症反应和细胞焦亡的影响.方法:将C57BL/6小鼠随机分为6组,每组8只,通过盲肠结扎穿刺法(CLP)手术构建CLP诱导的脓毒症小鼠模型:腹腔注射0.1 mg/kg的巴比妥麻醉,腹部纵向切开暴露盲肠,结扎盲肠并用注射器针头进行穿孔,挤出部分肠道内容物后缝合伤口.假手术组(Sham组)开腹后不做任何处理缝合伤口,无CLP 手术处理.治疗组分为 CLP+NC mimic 组,CLP+miR-135b-5p mimic 组,CLP+NC mimic+empty vector 组,CLP+消皮素D(GSDMD)组,CLP+miR-135b-5p mimic+GSDMD组.治疗组小鼠在CLP手术前一周皮下注射200μ1溶解于生理盐水的 NC mimic(200 nmol/L),miR-135b-5p mimic(200 nmol/L),empty vector(100 nmol/L),GSDMD vector(100 nmol/L),每天注射1次,连续一周.术后24 h采用二氧化碳窒息法实施安乐死.采用qRT-PCR检测小鼠肺组织样本中miR-135b-5p和GSDMD mRNA的表达水平;苏木精-伊红(HE)染色检测小鼠肺组织形态和损伤状态;采用5 ml生理盐水冲洗小鼠右肺3次,每次持续约3～5 min,收集肺泡灌洗液(BALF),酶联免疫吸附实验(ELISA)检测小鼠肺泡灌洗液(BALF)中GSDMD、白介素1 β(1L-1β)和白介素18(IL-18)的表达水平;蛋白免疫印迹法检测小鼠肺组织内含NLR家族PYRIN域蛋白3(NLRP3),半胱氨酸天冬氨酸蛋白水解酶1(caspase 1)以及切割后的N-端GSDMD端蛋白结构域(cleaved-GSDMD-N)的表达水平.双荧光素酶报告基因检测系统验证miR-135b-5p与GSDMD的靶向结合关系.结果:与对照组相比,CLP组小鼠肺组织中有大量的炎症细胞浸润,肺泡损伤,细胞间质水肿及肺泡塌陷等病理特征,小鼠肺组织内细胞焦亡相关蛋白(NLRP3,caspase-1和GSDMD)的表达水平明显增加(P＜0.01),但miR-135b-5p的表达水平明显下调(P＜0.01);与 CLP组相比,超表达miR-135b-5p能够明显抑制CLP诱导的小鼠肺组织内细胞焦亡(P＜0.01),靶向抑制GSDMD的表达水平(P＜0.01);超表达GSD-MD 能够逆转超表达miR-135b-5p对肺组织细胞焦亡的抑制作用(P＜0.01),超表达miR-135b-5p能够通过靶向GS-DMD抑制小鼠BALF中IL-1β 及IL-18的表达水平(P＜0.01).结论:miR-135b-5p靶向下调GSDMD抑制细胞焦亡,改善脓毒症引起的ALI,为脓毒症诱导的ALI治疗提供了潜在的治疗靶点和理论依据.

脓毒症;小鼠;急性肺损伤;miR-135b-5p;膜穿孔蛋白D;焦亡

臧宾宾;李华;杨颖;谢航;徐晓婷

河南省中医院重症医学科,郑州450002;郑州市中医院肝胆脾胃科,河南郑州450007

中国应用生理学杂志

[1]臧宾宾;李华;杨颖;谢航;徐晓婷-.miR-135b-5p抑制脓毒症引起的小鼠急性肺损伤(ALI)的作用及机制)[J].中国应用生理学杂志,2022(04):366-372

CLP+NC,CLP+miR,mimic+empty,mimic+GSDMD,穿孔蛋白

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