目的:探讨活化转录因子6(ATF6)对骨肉瘤细胞MCA205免疫原性的影响,初步解析其调控机制.方法:利用CRISPR-Cas9技术敲除MCA205细胞的Atf6基因,借助CCK-8实验、细胞能量代谢检测、流式细胞术、ATP检测试剂盒、干扰素刺激响应元件(ISRE)-荧光素酶报告细胞实验和qPCR法分别检测野生型(WT)和Atf6-/-MCA205细胞在PBS或衣霉素(Tm)处理后的活力、线粒体耗氧速率(OCR)和胞外酸化速率(ECAR)、磷脂酰丝氨酸外翻和细胞膜通透性、胞内钙离子动员、胞内外ATP浓度、IFN-a/b分泌和干扰素刺激基因(ISG)的表达水平.在免疫系统健全的小鼠皮下接种WT或Atf6-/-MCA205细胞,比较两者的成瘤速度、肿瘤组织基因转录图谱、局部抗肿瘤效应T细胞活化有无差异.将WT和Atf6-/-MCA205细胞分别接种于nu/nu小鼠背部两侧皮下,或将Atf6-/-MCA205细胞分别接种于免疫系统健全小鼠和Ifnar-/-小鼠皮下,记录肿瘤生长曲线.分别用Tm预处理的WT和Atf6-/-MCA205细胞对na?ve小鼠(未经免疫刺激的小鼠)进行初次免疫,使肿瘤抗原特异性T细胞发生初次活化(prime),随后收集引流淋巴结细胞并进行体外再刺激(boost),分析特异性T细胞再次活化有无差异.按照不同的效靶比,将NK细胞与染料标记的WT和Atf6-/-MCA205细胞共培养,流式细胞术检测细胞杀伤情况.结果:PBS或Tm处理后,WT和Atf6-/-骨肉瘤细胞活力和增殖、氧化磷酸化和糖酵解、离子霉素触发的胞内钙离子动员、胞内外ATP和IFN-a/b分泌均无显著差异.Tm处理后,Atf6-/-细胞死亡比例低于WT细胞(P<0.01).在免疫系统健全的小鼠体内,Atf6-/-肿瘤的生长速度明显低于WT肿瘤(P<0.05).然而,在缺乏T细胞的nu/nu小鼠体内,两种肿瘤生长速度的差异显著缩小.与免疫系统健全的小鼠相比,Ifnar-/-小鼠体内Atf6-/-肿瘤的生长速度略快(P<0.05).Atf6-/-肿瘤内免疫应答相关基因的表达、效应T细胞的活化均显著高于WT肿瘤(P<0.05).与WT MCA205细胞相比,Atf6-/-MCA205细胞与NK细胞共培养后死亡比例更高(P<0.05).在Tm刺激后,Atf6-/-MCA205细胞比WT细胞表达更多的Irf3和Irf7,前者在prime-boost实验中可刺激T细胞分泌更多的IFN-g.结论:阻断ATF6信号通路能显著增强MCA205细胞的免疫原性,促进免疫监视,阻碍肿瘤进展.

骨肉瘤;MCA205细胞;未折叠蛋白反应;肿瘤免疫原性;活化转录因子6;干扰素;T细胞;NK细胞

黄恩厚;李莫寒;李培培;夏琳;马瑜婷

南京医科大学 肿瘤个体化医学协同创新中心,江苏 南京211166;中国医学科学院 系统医学研究院,北京 100005;苏州系统医学研究所,江苏 苏州 215123

中国肿瘤生物治疗杂志

[1]黄恩厚;李莫寒;李培培;夏琳;马瑜婷-.ATF6对骨肉瘤MCA205细胞免疫原性的调控作用及其机制的初步探索)[J].中国肿瘤生物治疗杂志,2022(08):714-723

MCA205,Atf6,Irf3,Irf7

ATF6,细胞免疫,初步探索,骨肉瘤细胞,调控机制,CRISPR,Cas9,敲除,CCK,细胞能量代谢,流式细胞术,ATP,检测试剂盒,刺激响应,响应元,ISRE,荧光素酶,细胞实验,qPCR,野生型,WT,PBS,衣霉素,Tm,耗氧速率,OCR,ECAR,磷脂酰丝氨酸,外翻,细胞膜通透性,钙离子,IFN,干扰素刺激基因,ISG,免疫系统,皮下接种,成瘤,肿瘤组织,基因转录,抗肿瘤效应,细胞活化,nu,背部,Ifnar,肿瘤生长曲线,ve,免疫刺激,肿瘤抗原,prime,淋巴结,boost,NK,染料,细胞共培养,杀伤,伤情,细胞活力,氧化磷酸化,糖酵解,离子霉素,细胞死亡,生长速度,肿瘤内,免疫应答,免疫监视,肿瘤进展,未折叠蛋白反应,肿瘤免疫原性

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