目的:探讨神经纤维瘤蛋白1（NF1）在胆囊癌中的机制。方法:采用实验研究方法。培养人胆囊癌细胞系GBC-SD、NOZ、SGC996、EH-GB1、ZJU0428，人胚肾细胞系293T，人宫颈癌细胞系HELA；构建免疫共沉淀实验所需的重组质粒mRFP-YAP1 FL-FLAG和eGFP-MYC-NF1 2650~2750-HA，体外纯化Yes相关蛋白1（YAP1）截断体蛋白和NF1融合蛋白。分别采用等温滴定量热实验、GST pull-down实验、免疫共沉淀实验、免疫荧光和激光共聚焦检测NF1与YAP1的体内外相互作用，采用蛋白质免疫印迹法检测不同胆囊癌细胞系中NF1蛋白的表达水平。观察指标：（1）NF1与YAP1的体外相互作用。（2）NF1与YAP1的细胞内相互作用。（3）不同人胆囊癌细胞系中NF1蛋白的表达水平。结合解离常数由ITC200等温滴定量热仪自带软件输出，以 x±s表示。计数资料以绝对值表示。 结果:（1）NF1与YAP1的体外相互作用。①等温滴定量热实验结果显示：PPQY肽段滴定体外纯化YAP1的第1个WW1结构域蛋白存在相互作用，结合解离常数为（0.42±0.06）mmol/L；PPQY肽段滴定体外纯化YAP1的162~275蛋白区段存在相互作用，结合解离常数为（0.69±0.14）mmol/L。②GST pull-down实验结果显示：相对于GST蛋白和His-Sumo-YAP1 WW1反应体系，在GST-PPQY融合蛋白与His-Sumo-YAP1 WW1反应体系的蛋白泳道中可以观察到目的蛋白His-Sumo-YAP1 WW1；相对于GST蛋白和His-Sumo-YAP1 WW2反应体系，在GST-PPQY融合蛋白与His-Sumo-YAP1 WW2反应体系的蛋白泳道中可以观察到目的蛋白His-Sumo-YAP1 WW2。（2）NF1与YAP1的细胞内相互作用。①免疫共沉淀实验结果显示：在使用FLAG凝胶珠孵育共转染mRFP-YAP1 FL-FLAG和eGFP-MYC-NF1 2650~2750-HA的细胞裂解液中，观察到NF1蛋白的免疫印迹。②免疫荧光和激光共聚焦检测结果显示：在人胆囊癌细胞系NOZ的原位荧光中，YAP1和NF1荧光明显，主要定位于细胞质中。在人胆囊癌细胞系SGC996的原位荧光中，YAP1荧光明显，主要定位于细胞核中，NF1荧光不明显。（3）不同人胆囊癌细胞系中NF1蛋白的表达水平。蛋白印迹实验结果显示：以人宫颈癌细胞系HELA中NF1蛋白的表达量为标准，在人胆囊癌细胞系EH-GB1、GBC-SD、NOZ、SGC996、ZJU0428中，NF1蛋白的相对表达量分别为1.28、0、1.01、0、0。 结论:NF1可能通过直接作用于YAP1蛋白影响胆囊癌。

胆道肿瘤;神经纤维瘤蛋白1;Yes相关蛋白1;机制;研究

张凌宵;金朝晖;崔旭雅;邱世梅;董平;黄旲;刘颖斌

上海交通大学医学院附属仁济医院胆胰外科　上海市胆道疾病研究重点实验室　上海市胆道研究中心　癌基因与相关基因重点实验室（上海）上海市肿瘤研究所，上海　200127;上海交通大学医学院附属新华医院普通外科，上海　200092

中华消化外科杂志

[1]张凌宵;金朝晖;崔旭雅;邱世梅;董平;黄旲;刘颖斌-.神经纤维瘤蛋白1在胆囊癌中的机制研究)[J].中华消化外科杂志,2022(07):941-948

SGC996,ZJU0428,YAP1 ,NF1 ,ITC200,PPQY,WW1,WW2

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