典型文献
囊泡相关膜蛋白A调控牛病毒性腹泻病毒复制
文献摘要：
[背景]牛病毒性腹泻病毒(bovine viral diarrhea virus,BVDV)是致犊牛腹泻的重要病原之一,而目前BVDV与宿主因子互作机理研究较少,成为限制BVDV防控的重要原因.[目的]探明囊泡相关膜蛋白A (vesicle-associated membrane proteinA,VAPA)对BVDV复制的影响.[方法]根据GenBank中VAPA基因,使用Benchling和CHOPCHOP等平台设计靶向VAPA的向导RNA(small guide RNA,sgRNA),融合后克隆至慢病毒lentiCRISPR v2载体中,包装慢病毒后感染牛肾细胞(Madin-Darby bovine kidney,MDBK),使用嘌呤霉素连续筛选5代,使用Western Blot检测VAPA蛋白敲除(knockout,KO)情况;BVDV感染VAPA KO细胞不同时间后,收集细胞提取总RNA,并将等质量的RNA反转录成cDNA,使用实时荧光定量PCR (real-time quantitative PCR,RT-qPCR)和免疫荧光分析(immunofluorescence assay,IFA)分别检测BVDV5'-非翻译区(untranslated region,UTR) mRNA水平和双链RNA (double strand RNA,dsRNA)积累水平,于BVDV感染后不同时间观察致细胞病变(cytopathic effect,CPE)情况,并收集子代病毒液,使用Reed-Muench法计算子代病毒滴度变化.接种等量VAPA KO和乱码序列对照scramble细胞后不同时间进行活细胞计数,检测VAPA KO是否影响细胞活性.[结果]慢病毒感染后使用嘌呤霉素筛选,Western Blot检测VAPA蛋白明显降低,成功获得VAPA KO细胞;与对照scramble细胞相比,BVDV感染VAPA KO细胞后5'-UTR mRNA水平和dsRNA积累量均显著性降低,BVDV感染造成的CPE明显推迟并减轻,子代病毒滴度在12h和36h显著下降,在48 h极显著下降;与scramble细胞相比,VAPA KO细胞活性未受影响.[结论]VAPA KO后显著性抑制BVDV复制,为BVDV防控新技术的建立提供重要靶标.
文献关键词：
囊泡相关膜蛋白A;牛病毒性腹泻病毒;复制水平;双链RNA;病毒滴度
中图分类号：
作者姓名：
史慧君;袁圆圆;郭妍婷;陈俊贞;杨莉;冉多良;付强
作者机构：
新疆农业大学动物医学学院,新疆乌鲁木齐830052
文献出处：
引用格式：
[1]史慧君;袁圆圆;郭妍婷;陈俊贞;杨莉;冉多良;付强-.囊泡相关膜蛋白A调控牛病毒性腹泻病毒复制)[J].微生物学通报,2022(02):635-644
A类：
proteinA,VAPA,Benchling,BVDV5
B类：
囊泡,膜蛋白,牛病毒性腹泻病毒,病毒复制,bovine,viral,diarrhea,virus,犊牛腹泻,宿主因子,互作机理,vesicle,associated,membrane,GenBank,CHOPCHOP,平台设计,向导,small,guide,sgRNA,lentiCRISPR,v2,肾细胞,Madin,Darby,kidney,MDBK,嘌呤霉素,Blot,敲除,knockout,KO,细胞提取,录成,cDNA,real,quantitative,qPCR,免疫荧光分析,immunofluorescence,assay,IFA,翻译区,untranslated,region,UTR,双链,double,strand,dsRNA,时间观,致细胞病变,cytopathic,effect,CPE,集子,子代病毒,毒液,Reed,Muench,病毒滴度,等量,乱码,scramble,活细胞,细胞活性,慢病毒感染,推迟,12h,36h,靶标,复制水平
AB值：
0.334004
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