[目的 ]观察嗜肺军团菌重组免疫原蛋白(immunogenic protein,IP)对RAW264.7细胞自噬流及自噬相关因子表达水平的影响并探讨其作用机制.[方法]采用His标签蛋白纯化试剂盒纯化嗜肺军团菌重组免疫原蛋白(IP),并用CCK-8法检测IP对RAW264.7细胞半数抑制浓度(half maximal inhibitory concentration,IC50).采用低浓度(0.05×IC50)、中浓度(0.1×IC50)、高浓度(0.2×IC50)IP与RAW264.7细胞进行体外共培养1、3、6、12 h,并设细胞对照组,应用 自噬双标质粒pmCherry-C1-EGFP-LC3B检测巨噬细胞自噬流的变化,筛选最佳浓度进行后续实验;最佳浓度IP与RAW264.7细胞进行体外共培养6、12、24 h,并设细胞对照组,RT-qPCR检测各组自噬相关蛋白 Beclin1、微管相关蛋白 1 轻链 3(microtubule-associated protein 1 light chain 3,LC3)、SQSTM 1(sequestosome 1,p62)及组蛋白去乙酰化酶 6(histone deacetylase 6,HDAC6)的 mRNA表达水平;Western blotting法检测各组自噬相关因子的蛋白表达水平;免疫荧光检测各组自噬相关因子的表达.[结果]根据CCK-8结果计算IC50为 0.26 μg/μL.自噬双标质粒pmCherry-C1-EGFP-LC3B 检测自噬流结果显示,与 对照组相比,中浓度(0.026 μg/μL)IP与RAW264.7细胞进行体外共培养后自噬流抑制显著.RT-qPCR及Western blotting检测结果显示,与对照组相比,IP与RAW264.7细胞共培养6 h,P62表达水平升高,LC3B、HDAC6、Beclin1表达水平均降低,P＜0.05;与6h组相比,12h组LC3B表达水平降低,P62、HDAC6及Beclin1表达水平均升高,P＜0.05;与12h组相比,24 h组Beclin1表达水平升高,P＜0.05.IP 一定程度上以时间依赖的方式降低了 LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值并升高了 P62蛋白的表达水平,P＜0.05.免疫荧光结果基本与RT-qPCR及Western blotting检测结果一致.[结论]嗜肺军团菌IP抑制巨噬细胞自噬,可能与通过影响自噬小体-溶酶体融合途径,干扰自噬小体及自噬溶酶体的形成、成熟等过程有关.

嗜肺军团菌;免疫原蛋白;巨噬细胞;自噬

贺瑞霞;曹秀琴;陈民佳;郑荣慧;杨志伟

宁夏医科大学基础医学院病原生物学与医学免疫学系,宁夏银川750004;宁夏医科大学生育力保持省部级共建教育部重点实验室,宁夏银川750004

微生物学报

[1]贺瑞霞;曹秀琴;陈民佳;郑荣慧;杨志伟-.嗜肺军团菌重组免疫原蛋白(IP)对RAW264.7细胞自噬的影响)[J].微生物学报,2022(10):3886-3898

免疫原蛋白,SQSTM

嗜肺军团菌,RAW264,细胞自噬,immunogenic,protein,自噬流,相关因子,His,标签蛋白,蛋白纯化,试剂盒,CCK,半数抑制浓度,half,maximal,inhibitory,concentration,IC50,体外共培养,质粒,pmCherry,C1,EGFP,LC3B,巨噬细胞,最佳浓度,qPCR,自噬相关蛋白,Beclin1,微管,轻链,microtubule,associated,light,chain,sequestosome,p62,组蛋白去乙酰化酶,histone,deacetylase,HDAC6,blotting,蛋白表达水平,免疫荧光检测,结果计算,细胞共培养,P62,6h,12h,平降,时间依赖,自噬小体,融合途径,自噬溶酶体

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