目的 探究刚地弓形虫棒状体蛋白16(ROP16)在小鼠肺泡巨噬细胞(MH-S细胞)中的表达及其对细胞极化和凋亡的影响和相关机制.方法 利用携带绿色荧光标签的ROP16过表达慢病毒转染MH-S细胞,构建稳定表达ROP16的ROP16-MH-S细胞株(过表达组),同时设空载体慢病毒转染对照组(空载体组)和无转染对照组(对照组).转染72 h后免疫荧光法检测ROP16-MH-S中ROP16的表达及其在细胞中的定位.以甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)基因的转录水平为内参照,RT-qPCR检测ROP16-MH-S细胞中促炎(Ml)因子白细胞介素-1β(IL-1β)、肿瘤坏死因子(TNF-a)、IL-18、IL-6、IL-12和抗炎(M2)因子IL-10、转化生长因子-β(TGF-β),以及抑凋亡基因B细胞淋巴瘤/白血病-2(Bcl-2)和促凋亡基因Bcl-2相关X蛋白(Bax)、半胱氨酸蛋白酶3(Caspase 3)、Caspase 9等mRNA的相对转录水平;Western blotting检测ROP16-MH-S细胞中极化蛋白精氨酸酶1(Arg-1)、信号转导和转录激活因子3(STAT3)、705位点磷酸化(pTyr705)-STAT3、STAT6、pTyr641-STAT6和凋亡蛋白Caspase 9、Caspase 3、Bcl-2、Bax蛋白的相对表达水平;流式细胞术检测ROP16-MH-S细胞的凋亡情况.组间比较采用单因素方差分析.结果 转染后72 h,空载体组和过表达组90％以上的细胞可见较强的绿色荧光,过表达组细胞中可见明显红色荧光聚集在ROP16-MH-S细胞核及其周围.RT-qPCR结果显示,过表达组ROP16 mRNA的相对转录水平为8 023.459±39.325,高于空载体组(5.540±0.001)(F=83 188,P＜0.01);Western blotting检测结果显示,过表达组ROP16蛋白的相对表达水平为16.349±0.746,高于空载体组(1.291±0.333)(F=831.7,P＜0.01).RT-qPCR 结果显示,过表达组促炎(M1)因子 IL-1β、TNF-α、IL-18、IL-6、IL-12 mRNA 的相对转录水平分别为 0.495±0.002、0.337±0.007、0.378±0.014、0.474±0.035 和 0.730±0.021,均低于空载体组(0.994±0.043、1.165±0.034、0.943±0.005、1.153±0.028、0.926±0.031)(F=261.7、536.5、1 682.0、225.0、78.5,P＜0.01);抗炎(M2)因子 IL-10、TGF-p mRNA 的相对转录水平分别为7.013±0.032 和 1.608±0.024,均高于空载体组(0.790±0.031、1.091±0.027)(F=23 835.0、200.1,P＜0.01).Western blotting检测结果显示,过表达组Arg-1、pTyr705-STAT3、pTyr641-STAT6蛋白相对表达水平分别为2.337±0.089、3.471±0.046、3.905±0.045,均高于空载体组(0.871±0.014、1.482±0.071、1.514±0.050)(F=640.8、1 608.0、3 528.0,P＜0.01).流式细胞术检测结果显示,过表达组细胞凋亡率为(2.990±0.042)％,低于对照组(6.480±0.071)％和空载体组(5.655±0.290)％(F=219.7,P＜0.01).Western blotting 检测结果显示,过表达组促凋亡蛋白Bax、Caspase 3、Caspase 9的相对表达水平分别为0.558±0.005、0.640±0.011、0.593±0.026,Bax/Bcl-2 为 0.453±0.011,均低于空载体组(0.991±0.010、0.926±0.006、0.963±0.012、0.834±0.008)(F=2 850.0、1 200.0、359.3、2 337.0,P＜0.01).RT-qPCR 检测结果显示,过表达组促凋亡基因 Bax、Caspase 3、Caspase 9 mRNA 的相对转录水平分别为 0.588±0.086、0.563±0.025和0.403±0.014,Bax/Bcl-2 为 0.158±0.008,均低于空载体组(0.924±0.016、0.937±0.041、0.807±0.032、0.779±0.014)(F=24.7、78.6、154.9、265.5,P＜0.01);过表达组抑凋亡基因Bcl-2 mRNA的相对转录水平为3.702±0.362,高于空载体组(1.186±0.006)(F=104.1,P＜0.01).结论 ROP16蛋白在ROP16-MH-S细胞中(主要位于细胞核及其周围)稳定表达,可激活STAT3、STAT6,磷酸化Tyr705-STAT3、Tyr641-STAT6,进而调控细胞向M2极化,抑制细胞凋亡.

刚地弓形虫;棒状体蛋白16;小鼠肺泡巨噬细胞;凋亡;信号转导和转录激活因子3/6

李佳铭;王艺璇;杨宁爱;马慧慧;兰敏;刘春兰;赵志军

宁夏医科大学临床医学院,银川750004;宁夏病原微生物重点实验室,银川 750004

中国寄生虫学与寄生虫病杂志

[1]李佳铭;王艺璇;杨宁爱;马慧慧;兰敏;刘春兰;赵志军-.刚地弓形虫ROP16蛋白对MH-S细胞极化和凋亡的影响及其相关机制)[J].中国寄生虫学与寄生虫病杂志,2022(05):579-586

pTyr705,pTyr641,Tyr641

刚地弓形虫,ROP16,MH,细胞极化,相关机制,棒状,小鼠肺泡巨噬细胞,光标签,过表达,慢病毒转染,稳定表达,细胞株,空载,免疫荧光法,甘油醛,GAPDH,转录水平,内参,qPCR,促炎,Ml,M2,转化生长因子,TGF,凋亡基因,细胞淋巴瘤,白血病,Bcl,Bax,半胱氨酸蛋白酶,Caspase,blotting,精氨酸酶,Arg,信号转导和转录激活因子,STAT3,磷酸化,STAT6,相对表达,流式细胞术,单因素方差分析,红色荧光,细胞核,M1,白相,细胞凋亡率,促凋亡蛋白,可激活

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