[目的]流感病毒是一种人兽共患病原,常引起大流行,给人类健康造成巨大威胁,且流感病毒易发生变异,能不断逃逸宿主细胞的免疫反应,对现有抗流感药物产生耐药性,因此寻找抵抗流感的新方法迫在眉睫.研究通过探索NMRAL1(NmrA-like family domain-containing protein 1)对流感病毒复制的影响,并揭示其发挥作用的分子机制,为抗流感药物研发提供潜在靶点.[方法]采用siRNA干扰技术在A549细胞中下调表达NMRAL1,并通过Western Blot检测siRNA干扰后NMRAL1的表达水平;在下调表达NMRAL1的细胞中,分别感染A/Anhui/2/2005(AH05)(H5N1)和A/WSN/33(H1N1)两株不同亚型流感病毒,利用蚀斑试验检测感染病毒后24和48 h细胞上清中的病毒滴度.为确定NMRAL1影响流感病毒复制的具体阶段,在HEK293T细胞中瞬时转染NMRAL1-Myc-pCAGGS质粒过表达NMRAL1,通过双荧光素酶报告系统检测过表达NMRAL1对流感病毒聚合酶活性的影响;使用免疫荧光技术对流感病毒NP蛋白进行染色,通过激光共聚焦试验观察下调表达NMRAL1对感染病毒后3、4、5、6和8 h NP蛋白在被感染细胞中的定位情况的影响,判断下调表达NMRAL1是否影响流感病毒的入核和出核过程;利用Western Blot检测下调表达NMRAL1对流感病毒各病毒蛋白表达的影响和对流感病毒激活Ⅰ型干扰素通路下游IFN刺激基因(ISGs)表达的影响,利用间接免疫荧光试验进一步研究NMRAL1对流感病毒复制的影响.[结果]Western Blot检测发现NMRAL1 siRNA能显著下调NMRAL1表达,在下调表达NMRAL1的A549细胞中分别感染H5N1和H1N1病毒,并通过蚀斑试验检测感染病毒后细胞上清中的病毒滴度,结果显示在下调表达NMRAL1的细胞中,感染流感病毒后24和48 h收取的细胞上清中病毒滴度显著下降,表明NMRAL1能促进不同亚型流感病毒的复制;为进一步探索NMRAL1调控流感病毒复制的具体机制,利用双荧光素酶报告系统检测流感病毒聚合酶活性,发现过表达NMRAL1对流感病毒聚合酶活性无明显影响;激光共聚焦试验结果显示下调NMRAL1表达不影响NP蛋白的入核和出核过程,同时Western Blot检测表明下调NMRAL1表达不影响各病毒蛋白的表达;但荧光定量PCR试验结果显示下调NMRAL1表达能够促进流感病毒感染诱导的IFN-β mRNA水平上升,且Western Blot检测发现下调表达NMRAL1促进Ⅰ型干扰素通路下游的MxA和IFITM3抗病毒蛋白的表达,与此同时,间接免疫荧光试验结果显示下调NMRAL1表达可显著抑制流感病毒复制.[结论]在流感病毒感染过程中,NMRAL1不影响流感病毒的入侵以及转录翻译过程,而是通过抑制Ⅰ型干扰素通路激活从而抑制MxA、IFITM3等抗病毒因子的表达,最终促进流感病毒复制.研究证实宿主因子NMRAL1正调控流感病毒的复制,丰富了参与流感病毒复制的宿主因子网络.

NMRAL1;流感病毒;病毒复制;IFN-β;抗病毒基因

严娅;王广文;孔凡迪;王旭远;王一涵;李俊平;赵玉辉;李呈军;陈化兰;姜丽

中国农业科学院哈尔滨兽医研究所/兽医生物技术国家重点实验室,哈尔滨150069

中国农业科学

[1]严娅;王广文;孔凡迪;王旭远;王一涵;李俊平;赵玉辉;李呈军;陈化兰;姜丽-.NMRAL1对流感病毒复制的调控机制)[J].中国农业科学,2022(10):2067-2076

NMRAL1,NmrA,AH05

病毒复制,调控机制,人兽共患病,大流行,大威,逃逸,主细胞,免疫反应,抗流感,耐药性,like,family,domain,containing,protein,药物研发,潜在靶点,siRNA,干扰技术,A549,Blot,Anhui,H5N1,WSN,H1N1,两株,不同亚型,试验检测,感染病,上清,病毒滴度,HEK293T,转染,Myc,pCAGGS,质粒,过表达,双荧光素酶报告系统,系统检测,聚合酶活性,免疫荧光技术,NP,共聚,试验观察,病毒激活,干扰素通路,路下,IFN,ISGs,间接免疫荧光试验,收取,控流,具体机制,测流,流感病毒感染,MxA,IFITM3,抗病毒蛋白,翻译过程,病毒因子,宿主因子,正调控,子网络,抗病毒基因

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