为研究旋毛虫p53蛋白对血管内皮细胞通透性影响的相关机制,本研究以人脐静脉内皮细胞(HUVES)为细胞模型,通过体外实验利用不同浓度的旋毛虫p53重组蛋白(Ts-p53)刺激HUVES,采用CCK-8试剂盒筛选Ts-p53刺激HUVES细胞的最适浓度,通过Transwell小室方法检测内皮细胞通透性,利用荧光定量PCR(qPCR)检测细胞凋亡关键因子Bax、Bcl-2以及内皮细胞间连接蛋白Zo-1及VE-cadherin转录水平的变化,利用western blot方法检测细胞凋亡关键因子Bax、Bcl-2、Cytochrome C、Pro-Caspase-9、cl-Caspase-9、Pro-Caspase-3、cl-Caspase-3以及内皮细胞间连接蛋白Zo-1及VE-cadherin蛋白表达量的变化.结果显示,Ts-p53刺激HUVES细胞的最适浓度为60μg/mL.随着Ts-p53对HUVES细胞作用时间的增加,FITC标记的白蛋白在感染3 h、6h时内皮通透性Pa值逐渐上升,在12h时尤为明显,并与空白对照组相比差异极显著(P＜0.01),在刺激18h时渗出指数下降.阳性对照组为LPS刺激HUVES,该组HUVES内皮通透性Pa值约为空白对照组HUVES的1.9倍(P＜0.01).表明Ts-p53可以诱导HUVES通透性的增加.qPCR和western blot结果显示,与空白对照组相比,Ts-p53刺激3h、6h、12 h,Bax的转录水平和表达水平呈时间依赖性增加,在刺激12 h时其转录水平和表达水平最高(P＜0.01),18 h时其转录水平和表达水平降低,阳性对照组Bax转录水平和表达水平极显著高于其他组(P＜0.01).与空白对照组比,Bcl-2的转录水平和表达水平呈时间依赖性减少,在刺激12h时其转录水平和表达水平最低(P＜0.01),18 h时其转录水平和表达水平均增加,阳性对照组Bcl-2转录水平和表达水平均低于其他组.在刺激12h时,Bax/Bcl-2值最低.Western blot结果显示,与空白对照组相比,Cytochrome C表达水平也随着时间增加而增高,在12h表达量最大,18h表达量减少,阳性对照组该蛋白表达水平高于其他组,差异极显著(P＜0.01).随着刺激时间的增加,Caspase-3和Caspase-9蛋白被活化成cl-Caspase-3和cl-Caspase-9,均在12h时变化最为显著(P＜0.01),进一步验证了细胞凋亡的发生.与空白对照组相比细胞间连接蛋白ZO-1及VE-cadherin的转录水平和表达水平均呈时间依赖性减少,在12h表达量最少(P＜0.01).综上所述,本研究首次证实Ts-p53可以通过引发细胞凋亡、破坏内皮细胞间连接蛋白两种方式破坏内皮细胞屏障,使血管内皮细胞通透性增加,该结果为旋毛虫感染发病机制的研究奠定了基础.

旋毛虫;p53重组蛋白;通透性;线粒体凋亡通路

刁子洋;郭琨;王姗姗;王雪莹;侯嘉茗;薄禄琪;王爽;宋铭忻

东北农业大学动物源性人兽共患病黑龙江省重点实验室,黑龙江 哈尔滨 150030

中国预防兽医学报

[1]刁子洋;郭琨;王姗姗;王雪莹;侯嘉茗;薄禄琪;王爽;宋铭忻-.旋毛虫p53重组蛋白对血管内皮细胞通透性影响的研究)[J].中国预防兽医学报,2022(10):1099-1105,1110

HUVES

旋毛虫,p53,重组蛋白,血管内皮细胞,细胞通透性,相关机制,人脐静脉内皮细胞,细胞模型,体外实验,Ts,CCK,试剂盒,最适浓度,Transwell,小室,qPCR,关键因子,Bax,Bcl,细胞间连接,连接蛋白,Zo,cadherin,转录水平,western,blot,Cytochrome,Pro,Caspase,作用时间,FITC,6h,Pa,12h,空白对照,18h,渗出,阳性对照,LPS,该组,3h,时间依赖性,平降,蛋白表达水平,ZO,综上所述,两种方式,染发,线粒体凋亡通路

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