为建立一种可区分非洲猪瘟病毒(ASFV)野毒株和基因缺失疫苗株的荧光定量PCR方法,本研究根据ASFV HLJ/2018株(MK333180.1)I177L及p72基因序列,设计特异性引物及探针,经反应条件优化后建立一种双重TaqMan荧光定量PCR方法.绘制的标准曲线结果显示,两个重组质粒标准品p18T-I177L和p18T-p72相关系数R2均在0.99以上,扩增效率E为88％～90％.表明两个重组质粒标准品的拷贝数均与各自的Ct值有良好的线性关系.特异性试验结果显示,该方法仅特异性扩增ASFV I177L和p72基因,对猪瘟病毒(CSFV)、猪圆环病毒2型(PCV2)、伪狂犬病毒(PRV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪流行性腹泻病毒(PEDV)及猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)均无交叉反应;敏感性试验结果显示,该方法对p18T-I177L和p18T-p72质粒标准品的检测下限分别为4.63×102拷贝/μL和4.09×102拷贝/μL,敏感性较高;重复性试验结果显示,组内和组间重复性试验的变异系数均小于1.4％,重复效果好.分别利用该方法与ASFV荧光定量PCR检测试剂盒检测57份猪鼻拭子核酸样品,结果显示该方法检测出47份阳性核酸,10份阴性核酸样品.ASFV荧光定量试剂盒检测出46份阳性核酸,11份阴性核酸样品.二者的总符合率达94.7％,且二者的Kappa=0.825>0.75,P=1>0.05,表明两种方法无统计学差异且一致性良好.本研究建立的双重荧光定量PCR检测方法特异性强、敏感性高、重复性好,可用于ASFV的检测、鉴别检测和流行病学的调查研究.

非洲猪瘟病毒;双重荧光定量PCR;检测方法

曾繁聪;姜含雨;辛宁;柯骏鸿;罗瑞;何淑仪;张桂红;马春全;黄淑坚;陈耀

佛山科学技术学院生命科学与工程学院,广东 佛山 528225;佛山国康检测技术有限公司,广东 佛山 528225;华南农业大学兽医学院国家非洲猪瘟区域实验室(广州),广东 广州 510642

中国预防兽医学报

[1]曾繁聪;姜含雨;辛宁;柯骏鸿;罗瑞;何淑仪;张桂红;马春全;黄淑坚;陈耀-.基于非洲猪瘟病毒I177L和p72基因的双重TaqMan荧光定量PCR鉴别检测方法的建立)[J].中国预防兽医学报,2022(09):952-957

I177L,MK333180,p18T

非洲猪瘟病毒,p72,TaqMan,鉴别检测,ASFV,野毒株,基因缺失,疫苗株,究根,HLJ,基因序列,特异性引物,反应条件优化,标准曲线,线结,重组质粒,标准品,拷贝数,Ct,CSFV,猪圆环病毒,PCV2,伪狂犬病毒,PRV,猪繁殖与呼吸综合征病毒,PRRSV,猪流行性腹泻病毒,PEDV,猪传染性胃肠炎病毒,TGEV,交叉反应,敏感性试验,检测下限,重复性试验,检测试剂盒,猪鼻,鼻拭子,子核,核酸样品,符合率,Kappa,统计学差异,法特

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